除了关东御所，幕府还在各地设置了“守护”和“地头”，其名称虽与镰仓幕府相同，但是性质却各异。镰仓幕府的守护与地头都是将军的御家人，两者之间是主仆关系，而室町幕府的“守护”和“地头”多数由将军的直系族人和有力家臣担任。为了保护这些守护、地头的利益，室町幕府授予了其裁判诉讼、处理无主田地、征收税款的特权。这些守护、地头利用特权在地方大肆侵吞庄园，将管辖地的武士变成自己的家臣，培植自己的私人武装，逐渐发展为守护领国的守护大名。

这些守护大名在自己领国内肆意妄为，不奉幕府诏命，截留本应上缴给幕府的年贡，尤其是其日渐壮大起来的武装力量，对幕府构成了最直接的威胁。1391年，足利氏的同族、最大的守护大名，领有11国守护的山名氏清反叛，举兵向京都进攻。足利义满隧起兵讨平山名氏清，山名氏清战死，山名家势力急剧衰落，史称“明德之乱”。

在削弱了山名氏清家族的势力后，足利义满将下一个目标锁定在了大内义弘的身上。大内义弘拥有6国领地，是关西地区最有实力的守护大名。1399年，大内义弘宣布反叛幕府，足利义满亲任总大将，派遣细川氏、京极氏和赤松氏为前锋，以总兵力3.6万人攻打大内义弘。两军交战，大内义弘战死，幕府军队大获全胜。此役发生于应永六年，故史称“应永之乱”。

在削弱了各地守护大名的实力后，室町幕府加强了对财政方面的管理。除了分散各地的约200处的直辖领“御料所”为其主要经济来源外，幕府还增加了向各地大名征收年贡米和年贡钱的数量。幕府还在畿内的交通要道设“关所”，征收“关钱”，在渡口收取“津料”，并且对京都内的当铺业和酿酒业课征税收。

除此之外，与明朝进行的“勘合贸易”，也是室町幕府重要的财政收入来源。所谓“勘合贸易”，是明朝对外国来华进行朝贡贸易的一种称呼，也称“贡舶贸易”。“勘合贸易”必须在特定时间、特定地点进行。由于这期间倭寇猖獗，为了对倭寇和幕府官方船只加以区别，明朝发给室町幕府勘合符以示区分。幕府的贸易船只到港后，需出示勘合符，经明朝官员查验无误后，方能进行交易。

随着对外贸易的发展，一些港口城市日益显现出繁荣的景象，手工业和纺织业快速发展，不同产品之间的交换也日趋频繁，城市的商业形式也变得日趋多样。每月三次的定期市场“三斋市”从室町中期开始，改为每月六次的“六斋市”。随着市场的繁荣和货品种类的增加，还出现了类似于今天行业协会的组织——座。越是经济发达的地方，“座”越多。由于“座”的普及与发达，行业种类也随之增多，分工越来越细，促进了商品质量的提高。

随着商业活动的蓬勃发展，货物运输业也兴盛起来。在一些工商业发达地区，出现了“马借”、“车借”等运输组织。海上运输出现了驳船，容积达千石的也为数不少。